酶联接免疫吸附剂测定（ELISA）是一种广泛应用于生物医疗领域的免疫学检测技术，主要用于测定抗原或抗体的浓度。相较于免疫荧光和放射免疫技术，ELISA因其灵敏度高、操作简单而成为研究人员的首选。显色反应是ELISA过程中的关键步骤，酶催化无色底物转变为有色产物，其显色的深浅与样本中目标物质的浓度密切相关。

显色反应的影响因素

显色反应受到温度和反应时间的影响。在一定的反应时间内，阴性孔保持无色，而阳性孔则随着时间的延长而显色加强。为了加速反应，适当的提高温度也是有效的。在定量测定中，底物加入后的反应条件必须严格遵循规定，而在定性测定中，显色通常可在室温下完成，时间控制并不严格。

底物的选择与显色特性

以OPD为底物的反应，通常在室温或37℃下反应20到30分钟后显色达到稳定，延长反应时间可能导致本底值增高。OPD底物受光照影响会自发变色，因此显色反应应在避光条件下进行。显色反应结束后，需要加入终止液来停止反应，OPD的产物在硫酸作用下会由橙黄色转变为棕黄色。

TMB底物则不受光照的显著影响，可在室温下长时间观察反应结果。然而，为了确保结果的稳定性，应在规定的时间内读取数据。经过HRP催化后，TMB的显色约在40分钟内达到最大，随后会逐渐减弱。多种终止液可用于该反应，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂能使蓝色保持较长时间，有助于结果判断。

ELISA中的常见问题及解决办法

在使用ELISA进行检测时，常出现一些问题，以下是几个常见的情况及其解决方案：

1. 标曲不显色或显色很弱

这一问题通常是由于标准品未充分溶解或稀释时没有充分涡旋震荡造成的。胶环振荡能够增强溶解效果，确保样本均匀性，以提高显色强度。

2. 标曲和样本均不显色

如果在孵育阶段将试剂静置于桌面上，可能影响抗原与抗体的充分接触，从而导致显色弱。建议使用ELISA专用的微孔板振荡器，以确保有效的结合。

3. 标曲显色，样本不显色

这种情况往往被误认为是试剂盒的问题。实际上，当样本中目标蛋白浓度极低或干扰因素较强时，可能导致检测失败。当前，ELISA在蛋白检测中仍是灵敏度最高的方法，结合其他技术（如信号增强剂、高敏ELISA等），可提高检测灵敏度。

4. 标曲和样本都显色，但CV大

这一问题通常与移液器的使用及实验者操作习惯有关。规范的移液器使用能够减少误差，操作时可在空白板上练习，确保加样的一致性。

总之，Z6·尊龙凯时始终致力于提供高质量的ELISA试剂盒，帮助研究者克服常见的实验问题，提高实验结果的可靠性。随着技术不断进步，ELISA相关技术的多样化与灵敏度提升，将为生命科学的研究开辟更广阔的前景。