糖蛋白占人类蛋白质的50%以上，是大多数生物制药的关键成分。蛋白质糖基化是最广泛和复杂的翻译后修饰（PTM）之一，对调节各种生物过程至关重要。对糖蛋白一级序列的综合分析，包括糖基化位点的识别和相关聚糖结构，是研究糖蛋白功能的重要基础。液相色谱-质谱法（LCMS/MS）已成为鉴定蛋白质及其翻译后修饰的强大工具。与糖蛋白质组学中传统的数据库搜索策略不同，从头测序是一种创新的策略，且无需事先了解DNA或氨基酸序列。然而，由于多糖基化位点的复杂性，这种方法常面临序列覆盖不完整以及游离寡糖修饰谱不明确的问题，导致难以获得信息丰富的糖肽碎裂谱，从而影响从头测序的精准性。广泛的糖基化通常使得某些区域出现间隙，限制了其在单克隆抗体（mAb）中的应用，这些抗体具有一致的结构和已知的N-linked糖基化位点。基于这一背景，2025年在JACSAu(IF86)上发表的研究“Decoding Protein Glycosylation by an Integrative Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing Strategy”，介绍了一种通过质谱鉴定未知糖蛋白的方法，结合了糖基释放介导的从头测序与糖基化位点表征。该研究利用N-/O-糖的去糖基化技术，实现了全面的序列覆盖，结合EThcD片段化技术，能够高效识别优质长肽，进而促使精确的蛋白质组装。此外，该方法被进一步应用于复杂糖基化融合蛋白依那西普（Enbrel）及三种序列未知的新型肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂的从头测序，揭示了一级序列中的细微差异。在亚基、糖肽和聚糖层面，该研究也对这些蛋白质的N和O糖基化修饰进行了详细表征。这一策略弥补了从头测序与糖基化修饰之间的差距，提供了有关糖蛋白一级结构和糖基化修饰的全面信息，是糖蛋白准确测序的可靠解决方案，具有重要的基础研究和生物制药行业应用价值。

Z6·尊龙凯时的研究方法包括(i)使用N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，结合唾液酸酶，确保去糖基化效果，通过完整质量分析确认去糖基化成效，使用电子转移高能碰撞解离（EThcD）获取高质量肽段，并采用PEAKS AB分析其序列；(ii)在含18O的环境下，PNGaseF酶解将糖基化Asn转化为Asp并标记18O，进行定量分析；(iii)利用内切糖苷酶混合物（C型酶，包括EndoCC、EndoS和EndoH）处理样本，使用pFind分析处理后的质谱数据，验证N-糖基化位点的鉴定结果。

在这项研究中，作者提出了基于综合质谱法的蛋白质糖基化从头解码方法，使用含有唾液酸化N聚糖和O聚糖的模型糖蛋白Fetuin-A进行开发。该方法通过酶解糖苷键简化质谱分析和肽序列，并从去糖基化蛋白中获得一级序列。使用高度复杂的糖基化生物制药依那西普检验了方法的性能。同时，该策略也揭示了三种未知TNFR:Fc融合生物制剂的氨基酸序列，探索它们与依那西普的相似性。在多个层面上进行了糖基化表征，涵盖了N-糖基化位点的鉴定、游离寡糖分析、糖蛋白亚基分析及糖肽分析，实现了N/O糖基化的精确定位。

为了测试从头测序方法的稳定性并证明其在高度糖基化生物制药中的适用性，作者将该方法应用于已上市的高度糖基化Fc融合蛋白依那西普。依那西普具有至少3个N和13个O糖基化位点，利用开发的从头测序方法及EThcD碎裂技术，实现了其糖蛋白的深度覆盖，揭示了与三种未知TNFR:Fc生物制剂的氨基酸序列差异。

这项研究的结果表明，依那西普和三个未知TNFR:Fc生物制剂在特定氨基酸位点上存在差异，应用的质谱技术成功识别了N和O糖基化位点，并揭示了糖型异质性的情况。研究还通过与唾液酸酶结合的质谱检测，进一步分析了位点特异性的N-/O-糖基化差异。最终，该研究为深入理解生物制药中复杂的糖基化部分提供了重要的基础，标志着在这个领域的新突破。

总之，基于质谱的蛋白质从头测序在揭示氨基酸序列方面展现了强大的能力，与糖苷酶酶解和EThcD片段化相结合，提升了糖基化表征的准确性。这一新策略为深入研究高度糖基化蛋白质开辟了新思路。通过对依那西普的分析，该方法不仅提供了全面的信息，还明确了糖基化位点，揭示了糖型异质性的复杂性。鉴于CHO细胞系中表达的蛋白质普遍具有N-和O-糖基化的特点，这项研究为成功分析多种生物药物奠定了坚实的基础，极大地推动了这一领域的发展，展示了Z6·尊龙凯时在生物医疗研究中的重要地位。